猪繁殖与呼吸综合征的诊断技术(下)

⑶血清学检查

①免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）：将肺泡巨噬细胞加入微量滴定板各孔内，待细胞吸附着后，接种PRRS病毒，使每孔仅30％～50％细胞感染，以区别非特异性血清。经过孵育，细胞固定，用于血清学试验，每个血清板可用于11个双份血清检测。稀释被检血清，并在细胞上培养，如果试验血清中存在抗体，即与巨噬细胞胞质中的抗原结合。在第二次培养阶段，结合的抗体可用抗种的辣根过氧化酶（HPPO）结合物测定。最后，细胞与显色液/底物溶液共同培养。用倒置显微镜判断结果。这种方法特异性强，可测出感染后1～2周至12个月的抗体。

②间接荧光抗体试验（IFA）：荧光抗体试验是美国、日本、加拿大等国常用的血清学检测方法，抗原制备与免疫过氧化物酶细胞单层试验相同，可检测出感染后2～28天的IgM抗体，血清抗体效价低于1∶20者为阴性。

③酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA具有高度的特异性和敏感性，方便易行，操作过程和结果判断能标准化，且适用大规模的检测，法国目前已把ELISA法作为监测和诊断本病的常规手段。ELISA方法比IPMA方法能更早的检测出抗体。该方法可测定感染2周病毒后的抗体。其中，间接ELISA用于检测血清中抗体，PRRSV抗体，也可检测抗原。阻断ELISA（blockingELISA）法可大批量检测血液样品中的PRRSV抗体。阻断ELISA的敏感性和特异性最高。与另外两种方法相比，它成本较低廉，也更易于大面积推广。

④血清中和试验（SN）：本法主要用于检测PRRS抗体，具有良好的特异性，中和抗体的持续期比前两种方法都长，在病毒和待检血清混合物中加入20％猪血清以添加补体成分，并改变作用温度和作用时间，可以提高其敏感性。但血清中和试验需要进行细胞培养，费时费力，实验要求较高，猪感染PRRSV后，中和抗体出现较晚，所以在感染早期和急性感染的诊断中敏感性会下降。Morrison等（1992）用CL－2621细胞建立了SN试验方法，与IPMA和IFA相比，SN检出中和抗体较晚，Yoon等（1994）改良了SN试验方法，可在人工感染后11天检出中和抗体。鉴于采用同源毒株和异源毒株进行SN试验测得的中和抗体效价不同，而且SN方法费时费力，不适用于常规诊断。

⑷原位杂交法

进行原位杂交的cDNA探针主要是针对PRRSV－ORF7设计的，可以在肺、淋巴组织、肺泡巨噬细胞、淋巴结、肾脏的感染细胞内检测到PRRSV，其敏感性高于免疫组化法和免疫胶体金技术，检出的持续时间更长。此外，能够对PRRSV在体内器官中的动态分布情况进行追踪检测。根据不同基因型PRRSV的核酸序列设计合成不同的探针可区别不同基因型PRRSV的感染，将不同基因型的探针混合后进行原位杂交，则不同基因型的感染都可检出。