转基因猪的研究进展

摘要：转基因猪的研究是一项复杂的系统工程。本文简要介绍了基因转移的方法，并综述了转基因技术在猪的生产性能改良、抗病、非常规畜牧产品的生产及器官移植等方面的研究进展情况。

关键词：猪；转基因；抗病育种；

生物反应器中图分类号：S828．2

文献标识码：A

文章编号：0529-5130（2002）05-0040-03

转基因技术就是把某一动物的特殊基因从动物细胞中分离出来，然后把它再转移到另一种动物的细胞里，并使该动物获得前者的遗传特性，从而改造动物品种，获取人类所需的特殊物质。由于猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类最为相近，因此国内外科学家纷纷将目光瞄准了转基因猪的研究。

目前，主要研究集中于：

（1）通过转基因技术提高猪的生产性能，增强抗病力，最终育成满足人们需要的高产、优质、抗病新品种。1994年，德国成功培育出转入生长素的转基因猪，使世界上出现了壮如小牛的"超级猪"。

（2）通过建立人类疾病的转基因猪动物模型，揭示人类疾病的发病过程、机理及探索治疗途径。

（3）把转基因猪作为生物反应器，生产稀有的、用其他方法不易得到的、有生物活性的人类药用蛋白，这方面的研究最具诱惑力和商业价值。1991年美国DNA公司成功获得了能生产人血红蛋白的转基因猪。通过这些能高效表达的转基因猪来提供大量安全、廉价的血红蛋白，既可节约医药费，又能避免使用过期、有传染性（如肝炎、艾滋病等）的血液。

（4）利用转基因猪生产人体器官，为人体器官移植提供供体。本文就转基因猪的研究进展作一综述。

1外源基因的导入方法:目前基因转移的方法很多，但获得大量转基因动物的成功例子不多。

1.1DNA显微注射法:在转基因猪的研究中，显微注射法是最主要的方法之一。其基本原理是用精细的显微注射针将外源基因直接注入猪受精卵的雄原核，使外源基因整合到动物的基因组，从而获得转基因猪。该方法的优点是基因导入确实可靠，基因用量很省。缺点是成功率低，一般为1％～2％。因此，许多研究者分别从基因构件的设计、显微注射各技术环节的改进与完善等方面进行研究，以期提高生产转基因自的效率［1］。

1．2扎刺法:这个方法在显微注射法定量注射困难的基础上研究出来的。日本学者首先在培养细胞上选用扎刺法。扎刺法和显微注射法的针头相近，但更细，为0.5mm。其操作过程是先将胚胎放在含有目的基因的培养液里，然后用细针扎到细胞或细胞核里，针快速拔出，此时外源基因就进入细胞核，细胞膜结构的流动性随之而关闭，胚胎内进入的溶液很少。这种操作比显微注射快，对胚胎损害小，但转基因频率低。

1．3精子载体法:将精子与目的基因共育，在一定条件下使精子携带外源基因并进行人工授精，这样可将外源基因导入。这是转基因方法的重要突破，此法简便易行。但大多数研究表明，外源DNA吸附在精子表面或存在于细胞质中，不能整合到染色体上。但最近意大利科学家将克隆的目的基因与成熟的小鼠精子在缓冲液中孵育15min后，精子捕获了目的DNA。后来研究证明，用精子作为载体，外源基因必须有构型，才能被精子携带。目前，精子携带外源基因的机理正不断被揭示［2］。Sperandio等（1996）运用精子载体携带Psv2CAT基因，通过人工授精，得到82只仔猪，经检测获得5只转基因仔猪。新疆畜牧科学院绵羊中心农业部畜牧兽医生物技术重点实验室运用精子载体法得到145只仔猪中，8只为转基因猪［3］。

1．4逆转录病毒感染法:RNA病毒感染宿主细胞后，反转录成相应的DNA，并整合到宿主细胞的染色体DNA上，得到转基因动物。有人用人工组装的反转录病毒来感染小鼠的8细胞期或囊胚期胚胎，得到转基因鼠。现研究发现家禽至少有3种反转录病毒可以作为载体来获得转基因鸡，但仍未见到带有目的基因的反转录病毒直接感染产生转基因家畜的例子。

1．5电击法:也叫电脉冲刺激法或电场转移基因法。原理是外界的高电压脉冲可以改变细胞膜的结构，使膜产生可变性的电穿孔。从而使得一定大小的DNA分子通过细胞膜进入细胞核，并进一步整合到宿主DNA上。目前该方法主要用于植物的转基因上，澳大利亚科学家利用电击培育出高赖氨酸的玉米。用该法培育转基因动物的报道还未见到。

1.6胚胎干细胞介导法:胚胎干细胞（Embryonicstemcells,ES）是从早期胚胎的内细胞里分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的细胞。在植入正常发育的囊胚腔之后，会很快地与受体内细胞团聚集在一起共同参与正常胚泡的发育，因此将外源DNA导入ES细胞就可以实现由此发育而成的个体的基因转移。ES细胞在体外可以大量培养，并可在细胞水平上筛选转化子。转化后仍可进入生殖系统从而影响动物种系的性状，是哺乳动物基因操作的理想受体细胞。

2转基因猪研究应用,目前，转基因猪的研究主要集中在以下几个方面：

2．1生产性能的改良:1985年，科学家第1次将人的生长激素基因导入猪的受精卵获得成功。转基因猪与同窝非转基因猪比较，生长速度和饲料利用效率显著提高，胴体脂肪率也明显下降。此后，许多实验室以不同的启动子携带生长激素基因导入猪的基因组中，产生转基因猪。产生的转基因猪明显提高了饲料转化率、增重率，减少了脂肪，但却出现关节炎、胃溃疡、不育等副作用。Pursel等（l992）将MSV-cSKI基因转入猪的基因组，结果发现有5头猪在3～7月龄间明显地表现出不同程度的肌肉肥大，其中有2头猪仅表现为肩部过度肥大，另3头猪表现为大腿部和肩部明显增大。但另外5头猪从出生到3月龄则表现为前后腿肌肉松软、乏力。我国于1989年将猪GH基因转入湖北白猪受精卵中获得首批转基因猪，经几个世代的观察，其生长速度与饲料效率分别比同窝提高13．4％和10％［4］。最近，美国农业部的研究者采用GenemedicineInc．（TheWoodlandsTZ）公司的胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF－Ⅰ）基因培育出体胞减少的猪。并且将IGF-Ⅰ转基因猪与导入生长激素（GH）基因的基因工程猪进行了比较。结果表明，IGF－Ⅰ转基因猪的脂肪减少10％，瘦肉增加6％～8％，并且不出现导入GH基因的猪的问题。GH转基因猪有胃溃疡、嗜睡、怕热、生育力下降（不排卵）和食欲不振等症状。

2．2提高猪的抗病力:基因转移是降低家畜疾病易感性的免疫策略之一。对一些种属特异性的疾病，如果可以从抗该病的动物体中克隆出有关的基因，并将其转移给易感动物品种，则有希望培育出抗该病的品系。此外，在对畜禽类病原体基因组结构进行深入研究的基础上，可将病原体致病基因的反义基因导入畜禽细胞，使侵入畜禽机体的病原体所产生的mRNA不能表达，从而起到抗病作用。Lo等［5］将编码小鼠抗磷酰胆碱（PC）抗体的a＋k链融合基因一同注入猪的受精卵，从得到的转基因猪中发现。表达的鼠的IgA分子不能抑制内源性的Ig的产生，而且血清中的IgA不能与PC结合。相反，在转基因猪中产生的单克隆抗体已被证明有抗病活性。小鼠中有一种粘病毒抗性（Mx1）蛋白，它能阻断流感病毒A型的复制，使小鼠免受该病毒的侵染。1993年，Staeheli等将含有编码小鼠Mx1白的cDNA的3种基因构件分别转移到猪中，获得Mx1-转基因猪，但基因转移效率很低。在转基因猪中，未能检验出小鼠的Mxl蛋白，持续合成的Mxl还呈现胚胎期的有害作用［6］。湖北省畜牧所与中国农科院兰州兽医所合作，将抗猪瘟病毒（HCV）的核酶基因导入猪中，获得抗猪瘟病毒的转基因猪［7］。

2．3生产非常规畜牧产品:1985年，有人提出利用转基因动物乳腺生产重组蛋白质。数年间，这一近乎天方夜谭的神话已逐渐变成了现实。利用转基因动物生产人类药用蛋白等非常规畜牧产品，是目前世界上转基因研究的热点之一。其中，通过猪乳腺生产人类药用蛋白的研究已取得了初步成功。1991年，Wall等将小鼠编码乳清酸蛋白（WAP）的基因转移给猪，获得3头转基因猪，对这3头转基因猪的整个泌乳期的乳汁进行检测，发现鼠的WAP在奶中的浓度为lg/L，相应的mRNA只存在于乳腺中。在转基因猪的乳中，WAP占总乳蛋白的3％，表明外源基因在猪乳中高水平表达是可行的。Swansom等［8］用β-珠蛋白的4个核酸酶I的高敏位点连接人αl珠蛋白基因的2个拷贝和人βA珠蛋白基因的1个拷贝组成的融合基因产生的转基因猪与鼠的原型相似，产生的人血红蛋白二聚体占血细胞血红蛋白总量的9％。Sharma（1994）用同源性β珠蛋白基因作启动子，连接人β-珠蛋白基因组编码区，得到的转基因猪中高效表达了人的血红白。在一个转基因猪中的最高表达是有24％人血红蛋白和30％人α/猪β杂化血红蛋白。这头猪与非转基因猪繁殖的12头仔猪中，5头为转基因猪并高效表达了人血红蛋白。这表明通过转基因猪大规模生产人血红蛋白是可行的。Bleck等[9]从转基因猪体获得WAP。William[10，11]等在转基因乳汁中获得人体蛋白C（hPC），与从人血浆中分离的天然hPC生物学过性上一致。荷兰的Lubon等研究者将人凝血因子Ⅷ基因导入猪，并在猪乳中表达。然后利用这种转基因猪乳生产人凝血因子Ⅷ，此项研究获得成功。Lubon等将指导基因在乳腺特异表达的乳清酸性蛋白启动子下游与人凝血因子Ⅷ基因结合，注入猪的受精卵。其结果是猪乳中可分泌出活性型凝血因子Ⅷ。凝血因子Ⅷ蛋白生产出来以后，用特定的蛋白分解酶酶解，再通过糖基转移酶结合糖链，获得活性型蛋白。Paleyanda等［12］和Hennighausen等［13］报道，在转基因猪乳汁中，每毫升乳汁中含有大约2.7μg人凝血因子Ⅷ，比人血浆中的高10倍。尽管目前动物生物反应器的生产投入和风险都很大，但其诱人的商业前景和潜在的巨额利润还是吸引了不少投资者和科学家。有学者预言，利用动物（尤其是猪）乳腺生物反应器生产生物活性蛋白将发展为一个新兴的产业。

2．4器官移植长期以来，科学家一直在试图利用动物器官来使垂危病人起死回生，最开始的时候，科学家选择的是狒狒和黑猩猩，也有一些成功的例子，比如将狒狒的肝脏植入人体后，让病人活了71d；黑猩猩的肾脏植入人体后，也让病人活了9个月。但试验最终表明，这2种动物作为器官供体都没有太大的希望。因为狒狒器官太小，无法长期维持人体的生命；黑猩猩太珍稀，又和人类血缘太近，不可能宰杀以获取备用的器官。而且所有灵长目动物都可能携有致命的传染病因子。后来发现猪在体重和生理上与人相似、其器官与人的器官大小相仿，施行手术相对快速简单。并且猪容易饲养，成熟快，数量较多，也没有伦理和安全性方面的问题。异种移植器官的一个主要障碍就是补体介导的超敏排斥反应。而受体的先天性补体系统缺陷或用抑制剂抑制受体的补体系统就可以延长异种移植的存活［14］。对此，科学家已找到了一种巧妙的解决办法，即先将少量的人类基因注入到1～2个细胞阶段的猪胚胎中去。以后人类就可以得到一二只会天然产生这些保护性蛋白的转基因小猪了。这些特别培育的猪虽仍携带会使人类产生补体的半乳糖，但其器官组织由于已能经得起人类的补体，因而也就可以存活在人类的血液中间了。因此，可通过转基因方法在供体组织中表达受体的补体系统抑制剂、以克服异种移植器官而引起的补体介导的超敏排斥反应［15］。Rosengard等（1995）将人的补体抑制因子??衰退加速因子（hDAF）的基因通过显微注射到2443个猪胚中，经斑点分析得到46头转基因后代，其转基因拷贝数从1到30个不等。对其中的27只转基因猪通过免疫组织化学方法检测hDAF的表达水平。并根据hDAF在猪的内皮细胞、血管平滑肌和鳞状上皮细胞等3种主要细胞类型中的表达情况，分为广泛表达、中度表达、散在表达和无表达4种情况。结果6头为广泛表达，3头为中度表达，15头为散在表达，3头为不表达。Whitre等［17］、郑新民等［8］等也获得转DAF的猪，且Whitre等（1992）将获得的hDAF-转基因猪的心脏做体外血浆灌注试验，表明转基因猪的心脏具有阻碍人补体系统活化的能力。Whitre等报道，曾将hDAF-转基因猪中的心脏移植给猕猴，移植物能成活40d。但被移植和非转基因猪的心脏在6h内就出现急性排斥反应。我国也已开始这方面的研究。湖北畜牧所与同济医大合作已获得表达外源hDAF的猪7头［17］。

2.5我国成功研制出转基因猪皮:我国第三军医大学西南医院烧伤研究所将转基因技术与烧伤治疗紧密结合起来，经过不懈攻关，成功地研制出转基因猪皮。烧伤移植用转基因猪皮是选择适宜的诱导免疫耐受基因，通过一个载体将其转入猪皮，使猪皮产生与人皮结构相近的细胞因子。猪的体表面积大，皮源丰富，特别是猪皮在结构、理化特性及功能等方面均为人类的皮肤相似。因此，选中猪作为异种皮的供体，通过诱导免疫耐受基因直接转染猪皮使其达到满意效果。再综合运用一系列生物技术；制备成长期的、甚至终身不被人体所排斥的、能安全应用于临床的转基因猪皮，就能从根本上解决烧伤创面覆盖的难题。烧伤专家认为，转基因猪皮的研制成功，给烧伤医学带来了新的革命，更为重要的是给烧伤患者带来了福音。该项目与加拿大绿洲食品医药集团以1．8亿元人民币的价格达成合作开发协议。

3结语转基因猪的研究在短短几十年的时间内，已取得很大成就，目前仍处于发展阶段。某些产品虽已进入商业化生产，但仍有一些问题需要解决。建立更有效的外源基因导入和检测的方法需进一步完善。目前，外源基因转入的方法都存在转化率低。整合率低的缺点，所能够获得的转基因猪数量少，且常出现畸形或不育个体。转基因的快速检测系统是大批生产转基因猪的重要因素，外源基因在转基因猪上的表达也会出现时间或空间上的问题，即有异位表达和个体发育的不适宜阶段表达。所有这些问题都有待于进一步的探讨。

总之，转基因猪的研究是一项复杂的系统工程，随着时间的推移和科学技术的发展，转基因猪的研究将会取得更卓越的成绩，必将为人类带来更大的利益。